В идеале установление положения клонированного сегмента ДНК означает определение фланкирующих его последовательностей и того хромосомного сайта, по которому этот сегмент был включен в хромосому. Конечная цель такого картирования состоит в полном описании структуры хромосомы.
а. Молекулярная локализация
Характеристика клонированного сегмента. Прежде всего необходимо доказать, что клонированный сегмент действительно является репликой определенного геномного сегмента. Существует ли в геноме гомологичный сегмент с точно так же расположенными сайтами для рестриктирующих эндонуклеаз? Этот вопрос имеет важное значение, поскольку во время репликации в системе хозяин-вектор иногда происходит клонирование случайных последовательностей, образовавшихся в результате рекомбинаций, делеций или мутаций. Основной подход состоит в использовании клонированной ДНК в качестве зонда для анализа продуктов эндонуклеазного расщепления суммарной геномной ДНК, из которой произошел данный клонированный сегмент. Такой подход аналогичен описанному в разд.6.1. б с тем отличием, что зондом в данном случае является клонированная вставка, меченная 32Р. В эксперименте Б, клонированный зонд представлял собой субклонированный сегмент овальбуминового гена; материал, подвергнутый электрофорезу, - это coRI-гидролизат ДНК курицы. С зондом гибридизовался материал только одной полосы, представляющий собой фрагменты длиной 2,35 т.п. н. Этот эксперимент показывает, что 1) клонированная вставка в самом деле является фрагментом ДНК курицы;
2) в геноме гибридизующийся сегмент расположен между двумя EcoRI-сайтами, находящимися друг от друга на расстоянии 2,35 т.п. н.;
3) ни один из фрагментов любого другого размера не гибридизуется с зондом. Таким образом, клонированный фрагмент длиной 2,35 т.п. н., по-видимому, представляет собой истинную геномную последовательность и два аллеля в диплоиде являются идентичными, поскольку локализация этих EcoRI-сайтов совпадает.
Еще одна последовательность овальбуминового гена обнаружена в EcoRI-фрагменте длиной 1,8 т.п. н. После того как он был клонирован и использован в качестве зонда для анализа EcoRI-гидролизата ДНК курицы, были обнаружены три гибридизующихся фрагмента длиной 1,8; 1,3; 0,5 т.п. н. соответственно. Эти данные свидетельствуют о неидентичности двух аллельных овальбуминовых генов. Один из них содержит дополнительный EcoRI-сайт, разделяющий фрагмент длиной 1,8 т.п. н. на две части. Интересно, что столь простая процедура лежит в основе генетического анализа. Наследование двух или более аллелей легко прослеживается с помощью эндонуклеазного расщепления, электрофореза, ДНК-блоттинга и гибридизации между соответствующим зондом и ДНК, выделенной из разных источников. Единственным требованием является наличие полиморфных эндонуклеазных сайтов в аллелях любого гена или сегмента ДНК. Для проведения таких экспериментов достаточное количество ДНК можно получить из очень небольшого кусочка ткани или из нескольких миллилитров крови, поэтому метод может использоваться для анализа ДНК большинства видов, в том числе и человека.
Построение карты молекулы. Имея сравнительно короткие сегменты молекулы ДНК, такие, например, как ранее описанный субклонированный фрагмент длиной 2,35 т.п. н., можно построить детальную карту молекулы вплоть до установления ее нуклеотидной последовательности. Более длинные клонированные последовательности, подобные тем, которые присутствуют в Х-векторах или космидах, часто содержат несколько генов, а также другие сегменты ДНК, и могут использоваться для расширения карты. Так, субклонированный фрагмент овальбуминового гена длиной 2,35 т.п. н. служил зондом для поиска гомологичных последовательностей в космидной библиотеке, сконструированной из геномной ДНК курицы. Были отобраны две космиды с перекрывающимися последовательностями только в области зонда; вместе они составляли участок генома длиной 46 т.п. н., из которых 7,7 т.п. н. принадлежали самому гену овальбумина. Область, содержащая овальбуминовый ген, была идентифицирована благодаря образованию гетеродуплекса с овальбуминовой кДНК. Неожиданно обнаружилось, что два других участка сегмента длиной 46 т.п. н. также гибридизуются с овальбуминовой кДНК, хотя и в меньшей степени. При отжиге РНК из яйцевода курицы с космидами эти два участка гибридизовались также с двумя другими мРНК, отличными от овальбуминовой. Было высказано предположение, что в сегменте длиной 46 т.п. н. локализованы еще два гена, последовательность которых сходна с последовательностью гена овальбумина. Данное предположение получило подтверждение после проведения рестрикционного и гетеродуплексного анализа, а также после определения нуклеотидной последовательности. Эти два гена, обозначенные как X и Y, транскрибируются, как и овальбуминовый ген, в присутствии стероидных гормонов.
Прочие статьи:
Эпигенетические механизмы наследственности. Контроль активации генов
Существует мнение, что все свойства клетки и даже многоклеточного организма однозначно определены последовательностью нуклеотидов в ДНК. В настоящее время это положение подвергается критике. Выдвинуты представления об эпигенетических меха ...
Получение чужеродной ДНК
Чужеродную ДНК можно получить с помощью химического или ферментативного синтеза, либо из любого организма с последующим определением её первичной структуры.
Синтетически получают гены, в случае известной аминокислотной последовательности ...
Образование биологических форм
Прежде чем заняться этим вопросом вплотную, обратимся к экспериментам, которые помогут нам разобраться в механизмах образования форм организмов (и отдельных органов). Для таких целей в биологии — так же, как и в других науках — обычно при ...